整合素结合性信号分子抗体的操作步骤涉及多个关键环节，以下是基于相关研究的标准化流程总结：
一、样本制备与裂解
细胞裂解
使用含NP-40或Triton X-100的裂解缓冲液温和裂解细胞，确保整合素及其结合信号分子（如β-catenin、Talin等）保持完整。裂解后需离心去除不溶物，保留上清液用于后续实验。
预纯化处理
通过Normal IgG/微珠预纯化样品，减少非特异性结合干扰。
二、免疫共沉淀（Co-IP）
一抗孵育
稀释整合素信号分子一抗（如抗-FAK、Src、ILK等）于封闭液，4℃过夜或室温2小时。
（建议浓度参考说明书，通常1:100-1:500）
PBS漂洗3次，每次5分钟。
二抗孵育
荧光标记二抗（如Alexa Fluor 488/594）避光室温孵育1小时，PBS冲洗3次。
（若需核染色，可加入DAPI孵育5分钟）
洗涤与洗脱
用裂解缓冲液洗涤磁珠3-5次，去除未结合蛋白，最后用低pH洗脱液或SDS-PAGE上样缓冲液解离复合物
。
三、结果检测与分析
封片观察
抗淬灭封片剂（如ProLong Gold）封片，荧光显微镜或共聚焦显微镜观察。
对照设置
阴性对照：省略一抗或使用同型IgG；阳性对照：已知表达靶标的样本。
关键注意事项
样本保存：固定后4℃ PBS可短期保存，长期需-20℃冻存。
抗体选择：优先验证过整合素通路应用的抗体（如Phospho-FAK Tyr397）。
多色实验：确保抗体种属来源及荧光通道不重叠。
注意事项
抗体选择：需验证抗体特异性，避免交叉反应（如使用同型对照）。
时间控制：Co-IP孵育时间过长可能导致非特异性结合增加。
阴性对照：设置无抗体或无关抗体组，排除背景干扰。
