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戈氏放线菌PCR试剂盒使用方法

发布时间:2020/7/17   点击次数:44
 
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戈氏放线菌PCR试剂盒说明书

产品名称:戈氏放线菌PCR试剂盒
产品规格:50T
原理是由一对引物介导,能在动植物体外对特定基因(DNA)断进行快速酶促扩增,经过n个热循环扩增,扩增产物中所含特定基因数是原始模板数的(1+E)n(0<E<1,扩增效率=倍,使得检测扩增产物中的特定基因成为可能。产品仅用于科研实验

特异性强

PCR反应的特异性决定因素为:

①引物与模板DNA特异正确的结合;

②碱基配对原则;

③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性;

④靶基因的特异性与保守性。


产品特点:
本产品就是根据保守区设计引物而开发的高灵敏荧光定量 PCR 产品。
具有下列特点:
1.根据 指标的保守序列设计的专一性引物,与相关病毒无交叉反应。
2.灵敏度比常规 PCR 高 2-3 个数量级,可以达到几百拷贝/反应。
3.即开即用,用户只需要提供样品模板,操作简单,定量准确快速。
4.一管式荧光定量 PCR 检测,避免后续污染。
5.本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
6.本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。
规格及成分                            成分
 2×qPCR MagicMix                 500 μL(装 A 袋)
微量核酸稀释液(荧光 PCR 专用)1 mL(装 A 袋)
PCR 引物混合物                        100 μL(装 A 袋)
基因阳性对照                           50 μL(装 B 袋)
DNA 病毒裂解液(试用装)       15 次(9 mL)
使用手册                              1 份
运输及保存:低温运输、-20℃保存(A 袋试剂放样品准备区、B 袋的阳性对照分开放置),
自备试剂DNA 模板、10×ROX(根据机型决定,具体见使用方法)。
应用案例
样品 DNA 的制备
1.用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼 容。。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。 本试剂盒免费赠送 15 次 DNA 病毒裂解液试用装(一管式病毒 DNAout 的成分)。
稀释阳性对照(以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的长为 86bp 的 DNA 段作为阳性对照。
2.标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
3.用带芯枪头分别加入 45 μL 模板稀释液(用带芯枪头,下同)。
4.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡 1 分钟,得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。5.换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6.换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中,充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7.换枪头,在 4 号管中加 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照到 4 号管中,得1×10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。8.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
设置 qPCR 反应(20  μL 体系,在样品制备室进行)
9.在 PCR 管中加入下列成分(待测样品需要做三次重复,下表只列出一次。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):
注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照,其他荧光 PCR 仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX,则用水替代。
10. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR(具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行
优化)。
过程温度时间
预变性95℃1 分钟
PCR 反应95℃15 秒
(30 个循环)60℃15 秒
72℃15 秒
11. 数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时,
最大吸收光谱在 471 nm,结合 DNA 时的最大吸收光谱在 500 nm,最大发射光
谱在 530 nm。
四、数据处理
12. 以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品
的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。
组成及试剂配制:

1、酶标板:一块(96孔)

2、 标准品(冻干品): 2瓶,请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml,盖好后室温静置大约10分钟,同时反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为200 U/L,然后做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释),分别配制成200 U/L,100 U/L,50 U/L,25 U/L,12.5 U/L,6.25 U/L,3.12 U/L,样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制100 U/L标准品:取0.3ml (不要少于0.3ml )200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。

3、 样品稀释液:1×20ml。

4、 检测稀释液A:1×10ml。

5、 检测稀释液B:1×10ml。
注意事项:

1.基础程序;

2.扩增温度和延伸温度;

3.反应时间;

4.循环次数;

5.PCR 反应液的配制;

6.PCR技术的基本原理;

7.PCR的反应动力学;

8.PCR扩增产物;

9.PCR反应体系与反应条件。
【储存条件及有效期】:

-20℃避光保存,避免反复冻融,有效期6个月。

【适用仪器】:

ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等荧光定量PCR仪。

【样本采集、存放及运输】

u 样本采集:各类型样本按照常规方法采集;

u 存放:样本在2~8℃条件下保存应不超过72h,-70℃以下可长期保存,但应避免反复冻融(最多冻融3次);

u 运输:采用泡沫箱加冰密封进行运输。

【自备试剂】:产品仅用于科研实验

 
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