小鼠细小病毒染料法荧光定量 PCR 试剂盒说明书

【产品名称】

商品名称：小鼠细小病毒染料法荧光定量 PCR 试剂盒

【包装规格】50 次/盒

【产品及特点】

本公司开发小鼠细小病毒染料法荧光定量 PCR 试剂盒，它具有下列

特点：

1.即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。

2.引物根据小鼠细小病毒专一区设计，特异性高。

3.荧光定量 PCR 检测，比常规 PCR 更加灵敏。

4.一管式闭管操作，降低了交叉污染。

5.本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。

6.本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

【规格及成分】

成分 编号 塑料盒包装

2×qPCR MagicMix 90408 500 μL （棕色管）

荧光 PCR 专用模板稀释液 180701 1 mL （黄盖）

小鼠细小病毒染料法 qPCR 引物混

合液

4yw-8195 100 μL （白盖）

小鼠细小病毒染料法 qPCR 阳性对

照(1×10E8 拷贝/μL)

60908-81950

pc

50 μL （黄盖）

使用手册 LZ4W-8195 1 份

【运输及保存】

低温运输、 -20℃保存， 有效期一年。

【自备试剂】

DNA 模板、 超纯水、 10×ROX （根据机型决定，具体见使用方法） 。

【使用方法】

一、 稀释 PCR 阳性对照 （以 10E2- 10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀

释度为例）

1.注意： 由于阳性对照浓度非常高， 因此下列稀释操作一定要在独立的

区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分） 。

2.标记 6 个离心管，分别为 7， 6， 5， 4， 3， 2。

3.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（最好用带芯

枪头，下同） 。

4.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1

分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上

步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放

冰上待用。

6.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5

号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。 放冰上

待用。

7.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。 放冰上待用。

二、 样品 DNA 的制备

8.如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制

备阳性对照），一个是 NC （样品制备阴性对照）。 可以用 10μL PCR 阳

性对照的 10000 倍稀释的 （稀释后浓度为 1×10E4 拷贝/μL， 10μL

相当于 10 万拷贝，可以将 10μL 原液加入到 990μL 自备 TE 溶液中，

充分混匀，此为 100 倍稀释液。再取 10μL 此稀释液加入到 990μL 自

备 TE 溶液中，充分混匀，此为 10000 倍稀释液） 再加上一定量的水作

为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所

用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品

DNA。

9.用自选方法纯化 N+2 个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提

取试剂盒兼容。

三、 设置 qPCR 反应 （20 μL 体系，在样品制备室进行）

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管， 其中

N+2 个用于上 步得到的 N+2 个样品， 1 个用于 PCR 阴性对照， 6 个

用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个

PCR 管， 其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品， 1 个用于 PCR 阴

性对照（用水做模板）， 1 个用于 PCR 阳性对照（用 第 4 号阳性对照

稀释液， 浓度为 10E4 拷贝/μL） 。下面只描述定量分析的步骤，定性

分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个， 其余不变。

11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性

对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖

子储存好后最后加） ：

成分

样品管

N+2 个

PCR 阴性

对照管

PCR 阳性

对照管

（2-7 管）

2×qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL

小鼠细小病毒染料法 qPCR 引物混

合液

2 μL 2 μL 各 2 μL

自备 10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各 2 μL

N+2 待测样品 cDNA 模板 6 μL - - 自备超纯水 - 6 - 第 7 步所得 PCR 阳性对照 稀释

液（2-7 号） - - 各 6μL （2

号样到

2 号管，3

号样到 3

号管 …）

注:仅 ABI7500、 7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照， 其他荧

光 PCR 仪 器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、

RotorGene3000、 RotorGene 6000 和 LightCycler480） 不需要使用

ROX， 则用水替代。

12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR （具体 PCR 参数可以根据仪

器不同而自行优化）。

过程 温度 时间

预变性 95℃ 5 min

PCR 反应

（40 个循环）

95℃ 15 sec

60℃ 1 min，（采集 SYBR 通道的荧光信号）

按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、 数据处理

13. 如果把本试剂盒用于定量检测， 则以阳性对照浓度的 log 值为横轴， 以

Ct 值为纵轴， 绘制标准曲线。 再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出

样品 cDNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须

大于或等于 35。 阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线， Ct 值应

该小于或等于 30。对待测样品， 如果其 Ct 大于或等于 35 则为阴性， 如

果小于或等于 30 则为 阳性。如果在 30-35 之间，可结合熔解曲线判断，若

样品的熔解温度与阳性对照相同，该样本判断为阳性，否则为阴性。 【关联产品】

小鼠细小病毒探针法荧光定量 PCR 试剂盒