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钙调结合蛋白elisa试剂盒的实验原理及细胞培养步骤

发布时间:2021-11-23   点击次数:170次
  用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗MK抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗MK抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的MK呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
  钙调结合蛋白elisa试剂盒的细胞培养步骤
  1.培养基及培养冻存条件准备:
  1)准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640:GIBCO,货号21875-091);北美胎牛血清,20%;双抗1%。
  2)培养条件:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。3)冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。液氮储存。
  2.细胞处理:
  1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将有细胞悬液加入培养瓶中培养*(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养*)。第二天换液并检查细胞密度。
  2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。对于贴壁细胞,传代可参考以下方法:弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mMEDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
  3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。下面T25瓶为例;细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶,细胞变圆脱落后,加入2ml完全培养基终止消化,可使用血球计数板计数。1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮,加DMSO至*终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀,按每1ml的数量分配到冻存管中,注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。将冻存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
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