大鼠支气管成纤维细胞说明书

大鼠支气管成纤维细胞【Rat Airway: Normal Bronchial Fibroblasts】
       产品描述：公司提供的原代细胞均来自新鲜组织，公司提供的大鼠原代细胞均来自新鲜组织，用于培养该细胞的组织采集是根据标准方案进行。细胞的培养采用公司PrimaCellTM原代细胞培养试剂盒来优化目的细胞生长条件，以降低杂细胞的污染，同时保证质量的稳定。在公司生物技术部标准的操作流程下，原代细胞可以保持分化状态，进而可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。

原代细胞分离：
一、细胞培养
1取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的*培养称为原代培养。2培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。3冻存及复苏（可参阅后面有关章节）为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。
二、原代细胞分离
凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。1悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，方法是采用1000r/min的低速离心10分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。2实体组织材料的分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。
三、细胞增殖检测技术
目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以直接的证据应该采用方法一。其中常见检测：CCK8检测法 ，MTT检测法，Brdu检测法，Edu检测法，平板克隆形成。
四、细胞周期检测技术细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。常用的方法：流式检测细胞周期，标记有丝分裂百分率法。
五、细胞凋亡检测常见检测方法：流式检测细胞凋亡，线粒体膜电位，活性氧检测，Hoechst染色，电镜，TUNEL。
六、细胞转移能力检测常见检测方法：细胞划痕实验，Transwell实验，Invasion实验
细胞培养方法：
1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；
③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；
④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；
⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；
⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。
2、细胞复苏：
①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。
②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。
3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；
③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；
④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

大鼠支气管成纤维细胞说明书血清淀粉样蛋白   英文名称：   serum amyloid A protein   规格：   48T/96T   英文缩写：   SAA  Parecoxib   中文名：帕瑞考昔钠  分子式：C19H17N2NaO4S  度：98.0%

血清低密度脂蛋白（LDL）测试盒   Two semi test case  p-Anisoin  中文名：对茴香偶姻  分子式：C16H16O4  度：98.0%

血浓度测试盒   可见分光光度法   50管/48样  p-Anisil  中文名：茴香偶酰  分子式：C16H14O4  度：98.0%

血浓度测试盒   可见分光光度法   50管/48样  p-Anisil  1226-42-2  中文名：茴香偶酰  分子式：C16H14O4  度：98.0%  关键词： 

血浆游离基因组DNA提取试剂盒   Plasma free genomic DNA Exaction Kit  Panaxyne  中文名：  分子式：C14H20O2  度：97.0%

小鼠横纹肌辅肌动蛋白α(smActinin-α)ELISA试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装           Dicyclanil  112636-83-6  中文名：地昔尼尔  分子式：C8H10N6 

小鼠横纹肌辅肌动蛋白α(smActinin-α)ELISAKit   ELISA.   96T/48T  Minocycline   13614-98-7  中文名：  分子式：C23H28ClN3O7  度：98.0%  关键词： 

小鼠横纹肌辅肌动蛋白elisa试剂盒   小鼠横纹肌辅肌动蛋白试剂盒   规格型号：96T/48T   小鼠横纹肌辅肌动蛋白试剂盒，规格型号：96T/48T，来源：elisa试剂盒（进口分装），产品别名：小鼠横纹肌辅肌动蛋白试剂盒、小鼠横纹肌辅肌动蛋白eisa试剂盒   保存条件：2-8℃   保质期：6个月。  Lenalidomide  中文名：来那度胺  分子式：C13H13N3O3 

小鼠黑色素细胞抗体elisa试剂盒   小鼠黑色素细胞抗体试剂盒   规格型号：96T/48T   小鼠黑色素细胞抗体试剂盒，规格型号：96T/48T，来源：elisa试剂盒（进口分装），产品别名：小鼠黑色素细胞抗体试剂盒、小鼠黑色素细胞抗体eisa试剂盒   保存条件：2-8℃   保质期：6个月。  Dihydroisotanshinone II  260397-58-8  中文名：  分子式：C18H14O3  度：98.0%  关键词：  胶质鼠尾草; 二萜醌; 植物提取物; 天然产物; 天然产物库

小鼠黑色素细胞抗体(MCAb)ELISAKit   ELISA.   96T/48T  Methyl 1-[(2'-cyanobiphenyl-4-yl)methyl]-2-ethoxy-1H-benzimidazole-7-carboxylate  中文名：  分子式：C25H21N3O3

兔子凋亡信号调节激酶I(ASK-1)ELISA试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装           7,8-Dimethoxy-1,3-dihydro-2H-3-benzazepin-2-one  中文名：  分子式：C12H13NO3 

兔子胆固醇酯转移蛋白(CETP)ELISA试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装  7,8-Dimethoxy-1,3-dihydro-2H-3-benzazepin-2-one  73942-87-7  中文名：  分子式：C12H13NO3  度：98.0%  关键词： 

兔子胆固醇酯转移蛋白(CETP)ELISAKit   ELISA.   96T/48T              9,17-Octadecadiene-12,14-diyne-1,11,16-triol  中文名：  分子式：C18H26O3 

兔子单核细胞趋化蛋白1(MCP-1/CCL2/MCAF)ELISA试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装  7,8-Dimethoxy-1,3-dihydro-2H-3-benzazepin-2-one  73942-87-7  中文名：  分子式：C12H13NO3 

兔子单核细胞趋化蛋白1(MCP-1/CCL2/MCAF)ELISAKit   ELISA.   96T/48T  Thevetin B  27127-79-3  中文名：  分子式：C42H66O18  度：97.5%  关键词：

β-N-乙酰基葡萄糖苷酶（NAG）试剂盒（比色法）  3-Allylrhodanine  1457-47-2  中文名：3-烯丙基罗丹宁  分子式：C6H7NOS2 

β-（D3-H）测定试剂盒（酶比色法）  4-Allyloxy-2-hydroxybenzophenone  2549-87-3  中文名：4-丙烯氧基-2-羟基二苯甲酮  分子式：C16H14O3 

α-银环蛇(α-BGT)ELISAKit   ELISA.   96T/48T  Triptoquinone A  中文名：  分子式：C20H24O4 

α-岩藻糖苷酶（AFU）测定试剂盒（速率法）                    Xanthopurpurin  518-83-2  中文名：1,3-二羟基蒽醌  分子式：C14H8O4 

α戊二酸脱氢酶（α-KGDH）试剂盒   紫外分光光度法   50管/48样              Atrazine  中文名：阿特拉津  分子式：C8H14ClN5

操作步骤：产品仅供科研

1.将无菌的盖玻片置于细胞培养皿中，将细胞悬液接种于培养皿中进行细胞爬片，待细胞长至80%时取出爬片。
2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。
3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室温孵育爬片20min，使细胞通透。
4. 3% H2O2滴加爬片上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育15min（一般用甲醇或蒸馏水稀释30%过氧化氢），PBS冲洗3次，每次3min。
5. 封闭血清室温孵育20min，PBS冲洗3次，每次3min。
6. 细胞特异性一抗孵育：按照抗体说明书稀释比例稀释好一抗，滴加在爬片上，于4°C湿盒中孵育一夜，PBS冲洗3次，每次3min。
7. 二抗孵育：选与一抗对应的二抗，按比例稀释后滴加在爬片上，37°C湿盒中孵育30min，PBS冲洗3次，每次3min。
8. 将爬片周围水渍吸干，爬片上滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察，当出现棕黄色或棕褐色的阳性信号时用蒸馏水冲洗终止显色。
9. 复染：用Harris苏木素复染30s~1min，水洗后用1%的盐酸酒精分化，再用蒸馏水（或PBS）水洗返蓝。
10. 封片：将中性树胶滴在爬片一侧，再用盖玻片盖上，先放平盖玻片一侧再轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好的爬片平放置于通风厨中晾干。
11. 镜检观察。